Nasceu em 1822 na cidade de Dole. Iniciou os estudos no Colégio Royal em Besançon, transferindo-se para a Escola Normal Superior de Paris em 1843, onde estudou química, física, cristalografia, e se doutorou em ciências quatro anos mais tarde.
Em 1948 observou que o ácido racêmico apresentava dois tipos de cristais, que desviavam o plano de polarização da luz no mesmo ângulo porém em sentido contrário. Trabalho que deu origem à estereoquímica e lhe rendeu a concessão da "Légion d'Honneur" Francesa.
Entre 1849 e 1853 foi professor de Química da Universidade de Estrasburgo. Em 1854 foi nomeado reitor da Faculdade de Ciências na Universidade de Lille. Em 1857 assumiu o cargo de diretor de estudos científicos da Escola Normal de Paris onde instalou seu laboratório.
Entre 1857 e 1862 dedicou-se ao estudo dos processos de fermentação (alcoólica, butírica e lática). Demonstrou que toda fermentação deve-se à ação de microorganismos e que cada fermentação corresponde a um microorganismo específico. Constatou que seu estudo requer meios de cultura estéreis onde o fermento possa ser cultivado puro. Desenvolveu a técnica de pasteurização (eliminação dos microorganismos pelo calor) para a conservação de alimentos.
Os estudos sobre a fermentação o levaram à conclusão de que germes se originam de outros germes e portanto a refutar as teorias sobre geração espontânea. Realizou experimentos em apoio a suas posições.
Em 1865 descobriu os mecanismos de transmissão da pebrina, doença do bicho-da-seda que ameaçava a sericicultura em diversos países na Europa e Ásia menor. Constatou que era ao mesmo tempo contagiosa e hereditária, causada por um microorganismo que infectava os ovos postos pelas fêmeas contaminadas.
A partir de 1877 dedicou-se às doenças infecciosas (antraz, gangrena, septicemia), identificou o agente etiológico da osteomielite e dos furúnculos (o estafilococo), da infecção puerperal (o estreptococo) e o pneumococo.
Em 1880 desenvolveu procedimentos para atenuar a virulência dos micróbios o que lhe permitiu produzir vacinas contra o cólera das aves e contra o carbúnculo. Quatro anos depois apresentou os princípios gerais sobre a imunização contra as doenças infecciosas no Congresso de Copenhague. Em 1885 produziu uma vacina contra a raiva com que tratou com sucesso um menino de nove anos mordido por um cão doente.
Em 1888 fundou o Instituto Pasteur, que dirigiu até sua morte, em 1895,
Foi diretor do Museu de História Natural de Rouen, membro da Academia de Ciências (1862), da Academia de Medicina (1873) e da Academia Francesa (1881).
Publicou inúmeras obras entre as quais um conjunto de resultados sobre a questão do vinagre no bulletin de la Société chimique de Paris (1861), "Études sur les vins".(1866), estudos sobre a doença do bicho da seda (1870), estudos sobra a cerveja (1876), "La théorie des germes et ses applications à la médecine et à la chirurgie" (1878) e uma comunicação , sobre as doenças virulentas, onde expõe as princípios da imunização.